کاهش ویتامین A و کمبود انرژی

انجام پایان نامه

کاهش ویتامین A موجب تنش اکسیداتیو، اختلال در میتوکندری

و PARP-1 وابسته به کمبود انرژی می شود

چکیده:

سوال لاینحل مهم این است که چگونه ویتامین A موجب کمبود می شود و چرا رتینوئیک اسید در نقص ایمنی معکوس با شکست مواجه می شود. هنگامی که کمبود ویتامین A رخ می دهد، سلول های T دستخوش مرگ برنامه ریزی شده سلولی PCD می گردد که توسط رقیب طبیعی رتینول یعنی anhydroretinol افزایش می یابد. PCD توسط اپوپتوز علیرغم رخداد رویدادهای اولیه اشتراکی شامل دپلاریزاسیون غشای میتوکندری، منافذ نفوذپذیر گذرای باز و سیتوکروم c منتشر می شود. به طوری که فاقد فعال سازی کاسپاز ۳، ملاحظه کرماتین و اندونوکلئاز به واسطه تخریب DnA، نشانه اپوپتوز می باشد. PCD به تبعیت از کمبود ویتامین A افزایش تولید گونه های فعال اکسیژن ROS، کاهش های شدید در سطوح ATP و NAD  و فعال سازی پلی ADP ریبوز پلیمراز PARP-1 را ارائه می دهد. این مراحل مورد دوم مسبب محسوب می شوند زیرا خنثی سازی ROS، تحمیل شرایط هیپوکسی یا منع PARP-1 توسط رویکردهای ژنتیکی یا داروشناسی از کمبود انرژی و PCD ممانعت به عمل می اورد. به طوری که داده ها نقش تنظیمی جدید ویتامین A را در هموستاز انرژی میتوکندری مشخص می نماید.  انجام پایان نامه

ویتامین A ( رتینول) برای فرایندهای فیزیولوژیکی متنوع شامل بینایی، رشد و نمو جنین، تمایز پوست، تشکیل نطفه و عملکرد سیستم ایمنی ضروری محسوب می شود. انچه که دو مورد اخری را از بقیه تفکیک می نماید این است که انها وابسته به رتینول ROL اصلی می باشند، رتینوئیک اسید می تواند فقط به نحو ناقصی جایگزین ROL شود، البته حضور مکانیسم تمایز ژن کلاسیک الگوی transactivation مربوط به RA می باشد. در اصل کلیه بافت ها ویتامین A را جهت حفاظت در برابر تخریب ناشی از پروتئین متصل ROL سلولی مصرف می نمایند که جهت ذخیره ان را به رتینیل استر تبدیل می نماید و در صورت نیاز، توسط هیدرولیز استر، ROL ازاد را بازیابی می نماید. علاوه بر این ROL به لحاظ بیوسنتزی به تعدادی از متابولیت ها به غیر از RA تبدیل می گردد به طوری که نقش مستقیمی را در هسته ها ایفا نمی نمایند. در میان انها رتینول رترو هیدروکسیل ۱۴ و رتینول هیدروکسیل ۱۳،۱۴  مرتبط با برخی بافت ها و سلول ها شامل مواردی وجود دارد که در سنتز RA شناخته نشده اند. علاوه بر این، ROL وابسته به علمکردهای ظاهرا تکاملی قدیمی تر از تنظیم رونویسی RA می باشد که ابتدا در مرز بی مهرگان / مهره داران تکامل یافته اند. به طوری که بی مهرگان دارای ظرفیت متابولیزه نمودن ROL می باشند که توسط بیوسنتز رتینوئید هیدروکسیله فوق الذکر به همراه anhydroretinol ( AR ) در پروانه برگخوار پائیزه نشان داده می شوند.

این ملاحظات سوالی را در مورد اعمال بیولوژیکی متابولیت های ROL مذکور و در واقع عملکرد خود ROL را مطرح می سازد. به طوری که پاسخ جزئی از طریق کشف این موضوع که انها به عنوان به عنوان کوفاکتورهای ضروری در کنترل تکثیر مسیرهای سیگنالینگ و بقای لنفوبلاست های سلول B، لنفوسیت های T فعال شده، فیبروبلاست های موش و برخی انواع سلولی دیگر ارائه می شود. AR ، مشتق طبیعی، سلولی ROL می باشد که ضد خواص افزایشی ROL عمل می نماید. مبنای بیوشیمی برای عملکرد AR هنوز نامعلوم می باشد، ولی ممکن است مرتبط با ظرفیت جانشینی ROL از گیرنده معمول مکان هایی باشد که در سرین ترئونین کیناز شناسایی می شود. این مکان های گیرنده به صورت دامنه های تنظیمی خانواده های RAF و پروتئین کیناز C خصوصا دامنه های zinc finger مشخص گردیده اند که پناهگاه مراکز فعالیت انها محسوب می شود. با وجود این که مسیرهای فعال سازی کلاسیک از طریق پیام اور دوم diacyglycerol نامربوط می باشند، ولی این مکان ها می بایست توسط ROL برای فعال سازی کارا به واسطه سیگنال های تنش غیر کلاسیک خصوصا گونه های فعال اکسیژن اشغال شود.انجام پایان نامه کارشناسی ارشد

با وجود این که تایید مفهوم قبلی حالت مرگ سلولی ناشی از کمبود ویتامین A از طریق افزایش تشکیل ROS مشخص می شود، مطالعات قبلی حاکی از دیپلاریزاسیون غشای میتوکندری و از دست رفتن سریع تمامیت غشای پلاسمایی به عنوان پیامدهای اضافی ولی بدون فعال سازی اشکار caspase کاسپاسه یا تراکم کرماتین، دو نشانه مرگ برنامه ریزی شده سلولی اپوپتیک می باشد. کاهش های قابل ملاحظه در سطوح سلولی ATP  و NAD اشاره به میتوکندری به عنوان محل اصلی جراحت دارد ولی کمبود ویتامین A موجب فعال سازی پلی (ADP ریبوز) پلیمراز ( PARP(-1 می شود. PARP-1 بهترین عضو در میان خانواده PARP پروتئین های هسته، سنتز وابسته به NAd و اتصال واحدهای aDP- ریبوز به گروه های کربوکسیل باقی مانده های گلوی مربوط به پروتئین های گیرنده را تسریع می نماید. به طوری که شامل PARP-1 و هیستون ها، توپوایزومرازهای I و II، هلیکاز های DNA، عوامل ترمیم ناحیه تک رشته و استخراج باز می باشند. PARP-1 علاوه بر نقش ان به عنوان حسگر اسیب به DNA ، در ارتباط با تنظیم رونویسی، چرخه سلولی و مرگ سلولی نیز مطرح می باشد.

انجام پایان نامه

 

overactivation مربوط به pARP-1 تحت تنش سلولی با تشکیل منتجه از سطوح بالای PAR و پروتئین های اصلاح شده PAR اخیرا حاکی از ان است که علت کاسپاسه مستقل از مرگ سلولی در مدل های اسیب ناشی از ایسکمی و برقراری جریان مجدد ، دیابت ها، اسیب التهاب با واسطه و سمیت عصبی می باشد. چنانکه از مطالعات بر می اید مکانیسم های مرگ سلولی ناشی از PARP-1 شامل شکست انرژی ناشی از بهره برداری سریع NAD و ATP، اختلال رونویسی و سیگنالینگ با واسطه PAR به میتوکندری می باشد. با کاربرد رویکردهای داروشناسی و ژنتیک هم اکنون نشان می دهیم که کمبود سلولی ویتامین A علاوه بر ضدیت عادی سیگنال های وابسته به بقای ROL توسط AR، تنش اکسیداتیو مداوم، اختلال میتوکندری، فعال سازی PARP-1 و در نهایت نکروز مرگ سلولی ناشی از بحران بیوانرژی را تولید می نماید. به طوری که قابل توجه است پاسخ پاتولوژیک میتوکندری تاکنون به عنوان هدف پنهان تنظیم ویتامین A  مشخص شده است.

مواد و روش ها:

معرف ها:

ROL ، اسید hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic (Trolox)، کربونیل سیانید ام کروفنیل هیدرازون، ( CccP) ، میگزوتیازول، اسید رتینوئیک p-hydroxyanilide  ( ۴-HPR، فنتره نید)، ۱,۵-isoquinolinediol ( DHIQ ) و فرمالدئید از Sigma-Aldrich خریداری شده بودند. پروپیدیم یدید، tetramethylrhodamine اتیل استر پرکلرات ( TMRE) و ۵-(and-6کربوکسی-۲′,۵ (،۷′-DCF دی استات  (کربوکسی -DCFDA) از  Invitrogen تهیه شده بودند. موش ضد انسانی PAR از BD Biosciences خریداری شده بودند. Mouse ضد انسان PAR از BD Bioscience خریداری شده بود. Mouse ضد انسان Fas از Upstateخریداری شده بود. CD90 (Thy1.2) MicroBeads از MiltenyiBiotec خریداری شده بودند. Boc-Asp(OMe)-CH2F (Boc-D-FMK) از Biosciences خریداری شده بودند.

حیوانات و سلول ها:

موش C57BL/6 از ازمایشگاه جکسون تهیه شده بودند. موش نر برای کلیه ازمایشات مورد استفاده واقع شده بود. حیوانات مطابق با اصول راهنمای خدمات سلامتی حیوانات مرکز سرطان مموریال اسلون کترینگ MSKCC نگهداری و تربیت شده بودند. کلیه ازمایشات مربوط به موش تحت پروتکل تایید شده از سوی موسسه مراقبت حیوانات و کمیته بهره برداری MSKCC انجام شده بودند. سلول های t jurkartاز کلکسیون نوع فرهنگی امریکایی خریداری شده و در RPMI 1640 رشد یافته و با ۱۰% FBS غیر فعال گرما تکمیل شده و در ۳۷ درجه سانتی گراد با ۵% دی اکسیدکربن نگهداری شده بودند. جهت ازمایشات هیپوکسی، سلول ها در معرض هیپوکسی ( ۳۷ درجه سانتی گراد، ۱% اکسیژن، ۵% دی اکسیدکربن، ۹۴% نیتروژن) با محیط کشت متعادل شبانه به همراه مخلوط گاز هیپوکسی در اتاق انکوباسیون مدولار قرار داده شده بودند.انجام پایان نامه ارشد

زیست پذیری سلول:

سلول های t jukart ، CD90 سلول های T توسط انتخاب immunomagnetic از طحال موش های C57BL/6 یا نوع وحشی و موش PARP-1 فیبروبلاست جنینی در سرم فاقد رسانه TLB شامل AR ( با یا بدون بازدارنده) به مدت ۱ الی ۲۴ ساعت در ظروف کشت شده بودند. معرف تکثیر سلولی به جوکارت t ، Thyl یا سلولهای MEF برای دو ساعت اضافی اضافه شده بودند. جذب با استفاده از قرائت کننده ای تعیین شده بودند. زیست پذیری به صورت درصدی از کنترل سلول های درمان نشده بیان شده بود. به طور مجزا، سلول های T جورکات جمع اوری شده بودند، با ice-cold ( یخ سرد) PBS شسته شده و با ۱۰ میکرو گرم بر میلی لیتر پروپیدیم یدید به مدت ۵ دقیقه در دمای اتاق علامت زده شده بودند. سلول های پروپیدیم یدید بر یک FACScan بدست امده بودند و با استفاده از Flow jo مورد تحلیل قرار گرفتند.

انجام پایان نامه

روش های اپوپتوز:

روش اپوپتوز از طریق تشخیص جریان cytometric شکاف کاسپاز -۳ و روش TUNEL مورد سنجش قرار گرفته بود. سلول های T jukart در ۴ میکرو مول AR به مدت ۶ ساعت انکوبه شده و در یخ سرد PBS شسته شده، در ۳% فرمالدین به مدت ۱۰ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد تثبیت شده و در ۹۰% یخ سرد متانول به مدت ۳۰ دقیقه بر یخ نفوذ پذیر شده بودند. سلول ها به مدت ۶۰ دقیقه در دمای ۲۵ درجه سانتی گراد با انتی بادی پلی کلونال شکاف کاسپاز -۳، به دنبال ان ایموگلوبین ضد خرگوش به برچسب  Alexa-Fluor488 به مدت ۳۰ دقیقه در ۲۵ انکوبه شده بودند. برای کیت تشخیص TUNEL در تشخیص مرگ سلولی در محل استفاده شده بود. مختصرا، سلول ها در یخ خنک PBS شسته شده، در ۲% فرمالدئید به مدت ۶۰ دقیقه در ۲۵ درجه سانتی گراد تثبیت شده بودند، در ۰٫۱%   Triton X-100 سیترات سدیم نفوذ پذیر شده و در مخلوط واکنش TUNEL به مدت ۶۰ دقیقه در ۳۷ درجه سانتی گراد تاریکی انکوبه شده بودند. انتی بادی کاسپاز-۳ اتصال و برچسب گذاری بر شکندهای رشته DNA بر FACScan با استفاده از FlowJo تحلیل شده بودند. حداقل ۱۰۰۰۰ سلول از هر نمونه مورد تحلیل قرار گرفته بودند.

پتانسیل غشای میتوکندری:

پتانسیل غشای میتوکندری توسط جریان سیتومتری با استفاده از TMRE، معرف قابل نفوذ غشای کاتیونی اندازه گیری شده بودند. سلول ها با TMRE به مدت ۳۰ دقیقه درمان سلول بارگذاری شده بودند و سپس در یخ سرد PBS شسته شده بودند، روش سلولی بر FACscan اندازه گیری شده و داده ها با استفاده از FlowJo مورد تحلیل قرار گرفته بودند. حداقل ۱۰۰۰۰ سلول از هر نمونه مورد تحلیل قرار گرفته بودند.

ATP و اندازه گیری NAD:

بعد از درمان، سلول های jukart T با PBS سرد شسته شده و در لوله های جداگانه جمع اوری شده بودند. برای اندازه گیری ATP، نمونه ها در بافر جوش، ۱۰۰ میلی مول Tris با ۴ میل%